蛋白磷酸酶：負責磷酸化蛋白的去磷酸化

磷酸化主要是針對磷酸化位點制備的，可以特異性識別磷酸化氨基酸位點，檢測蛋白磷酸化水平，對磷酸化蛋白進行定性、定量分析。磷酸化抗體可以用來檢測該蛋白在細胞受到刺激時的磷酸化水平的變化情況，側(cè)重于了解該蛋白的一種活性狀態(tài)，哺乳動物細胞中約30%的蛋白質(zhì)在一個或多個位點被磷酸化，不適當?shù)牡鞍踪|(zhì)磷酸化是許多人類疾病的原因。

一個蛋白可以有多個氨基酸位點發(fā)生磷酸化，那么有哪些氨基酸容易發(fā)生磷酸化呢？下圖展示了磷酸化類型以及常見磷酸化位點：

 O-磷酸化類型常見，在酸性條件非常穩(wěn)定，因此在細胞生物學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中研究廣泛。N-磷酸化不穩(wěn)定導(dǎo)致其檢測具有挑戰(zhàn)性。S-磷酸化和�；�磷酸化的研究報道很少。

那么如何確定一個蛋白存在哪些磷酸化位點呢？下面以uniprot 網(wǎng)站為例給大家介紹下查找方法：

1.通過https://www.uniprot.org/鏈接進入uniprot 官網(wǎng)，主界面如下：

2.以人源TAU蛋白為例，在search欄輸入TAU,進入如下界面，找到human TAU：

3.點擊P10636進入后，點擊左側(cè)PTM/Processing查看蛋白修飾情況以及修飾的氨基酸位點：

磷酸化蛋白WB檢測樣本制備有哪些注意事項呢？

1.快、狠、準。蛋白磷酸化是一個快反應(yīng)，制樣過程要迅速，樣品要新鮮，全程冰上操作。所有用到的試劑，器具要提預(yù)冷。制備的樣本需要盡快變性并放在-80°保存，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致磷酸基團降解。

2.裂解液中一定要加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，否則條帶出來會很淺。細胞裂解會釋放大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，會催化磷酸化蛋白去磷酸化。還要注意檢測蛋白磷酸化位點是什么氨基酸，如果是酪氨酸位點磷酸化還要加1μmol/L的原釩酸鈉。

磷酸化蛋白WB檢測內(nèi)參如何選擇？

磷酸化蛋白檢測需要設(shè)置2個內(nèi)參，一個是普通內(nèi)參比如actin或GAPDH, 確保上樣量一致；另一個是磷酸化蛋白對應(yīng)的總蛋白，比如檢測AKT磷酸化，同時還要跑一個AKT總蛋白的抗體，只有磷酸化蛋白與總蛋白比值變化了才能說明書磷酸化水平發(fā)生改變了。

WB實驗需要提高上樣量嗎?

磷酸化蛋白表達豐度低，大概只有總蛋白10%甚至更低，所以每孔需要足夠蛋白量，必要時對細胞進行特定刺激提高磷酸化蛋白表達水平。如下圖展示，F(xiàn)Nab10910 anti- Phospho-p53 (Ser15) antibody ，UV刺激后細胞的磷酸化蛋白表達水平升高。

磷酸化蛋白檢測用什么封閉液以及一抗孵育條件？

轉(zhuǎn)膜后，建議用5%BSA封閉1小時，非實驗別奶粉可能含有磷酸酶等雜質(zhì)，不適用于磷酸化蛋白檢測。封閉時間過長也會導(dǎo)致抗原標為掩蓋。

一抗孵育建議4℃過夜，不僅讓抗體有充足時間結(jié)合，低溫環(huán)境使蛋白不容易從膜上脫落。