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點(diǎn)擊次數(shù)：2885 發(fā)布時(shí)間：2024/4/18 16:13:10
ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，其基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。ELISA技術(shù)作為免疫標(biāo)記技術(shù)（包含免疫熒光技術(shù)，免疫放射技術(shù)，免疫酶技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)）中的一種，已廣泛應(yīng)用于科研和臨床實(shí)驗(yàn)中，具有快速、定性或者定量的特點(diǎn)。
一、包被和封閉的原理
實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要將抗原或捕獲抗體包被于固相載體上，通過檢測(cè)分子（酶或熒光基團(tuán)），將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，以O(shè)D值或發(fā)光值的結(jié)果，對(duì)靶蛋白進(jìn)行定量分析。
ELISA中的固相載體物很多，常用的是聚苯乙烯，具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)吸附性。具有可制成各種形式，且不參與化學(xué)反應(yīng)的特點(diǎn)。與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯，它質(zhì)軟板薄，可切割，價(jià)廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時(shí)也略高。除塑料制品外，固相酶免疫測(cè)定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜；另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的。
在ELISA中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵。ELISA 所用抗原有三個(gè)來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動(dòng)物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化。重組抗原和多肽抗原均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾少的優(yōu)勢(shì)。但制備的技術(shù)難度較大，制備成本高。
將抗原或抗體固相化的過程稱為包被。因?yàn)檩d體的物質(zhì)不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板為載體時(shí)，需將抗原或抗體溶于緩沖液中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 過夜。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面能被此蛋白質(zhì)全部覆蓋，后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會(huì)部分地吸附于固相載體表面，產(chǎn)生非特異性顯色，導(dǎo)致本底值偏高。在這種情況下，需要在包被后用其他溶液再包被一次，消除干擾，這一過程也被稱為封閉。
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
建議將96微孔板的兩列設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)品點(diǎn)樣孔，同時(shí)設(shè)置8個(gè)梯度濃度，2列復(fù)孔，將標(biāo)準(zhǔn)品工作液由低濃度到高濃度、依次從下至上加入酶標(biāo)板中。
微孔板條的后10列可設(shè)置為待測(cè)樣品點(diǎn)樣孔，一般設(shè)置2~3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，可設(shè)置正常組、模型組、給藥組等。根據(jù)檢測(cè)的相關(guān)指標(biāo)，選擇是否稀釋樣本以及樣本稀釋的濃度。
三、實(shí)驗(yàn)操作
例如：Human IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit
檢測(cè)試劑準(zhǔn)備
提20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡到室溫(18-25°C)。如果試劑盒需分多次使用，請(qǐng)僅取出本次實(shí)驗(yàn)所需的酶標(biāo)板條及標(biāo)準(zhǔn)品，剩余酶標(biāo)板條和標(biāo)準(zhǔn)品需按規(guī)定條件保存。
1.洗液：
用去離子水或蒸餾水(推薦電阻率為18MΩ的超純水)將30ml濃縮洗滌液(48T為15ml)稀釋至750ml(48T為375ml)并混勻�；蛞缹�(shí)驗(yàn)所需，取適量濃縮洗滌液稀釋至25倍體積并混勻，將未使用的溶液放回2-8°C。
如果濃縮的洗滌液中形成了晶體，可以在40°C水浴中加熱(加熱溫度不應(yīng)超過50°C)，直至晶體全部溶解，混勻后使用。
配制好的洗液，建議當(dāng)天使用完，用不完的，可以保存在2-8°C，不超過48小時(shí)。
②300pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)記為零號(hào)管)的制備：加入1ml樣品稀釋液到標(biāo)準(zhǔn)品管中，旋緊管蓋，室溫靜置2分鐘，上下顛倒數(shù)次輕輕混勻(或加入1 mL樣品稀釋液，靜置1-2分鐘后，用低速渦旋儀混勻3-5)。1000×g低速離心1分鐘，將液體收集至管底。
③倍比稀釋：另取7個(gè)EP管，分別標(biāo)記為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64和blank。先在每個(gè)EP管中分別加入0.3ml的樣品稀釋液。再取0.3ml零號(hào)管標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到1/2管中，充分混合。再取0.3ml 1/2管標(biāo)準(zhǔn)品溶液到1/4管中，充分混合。再取0.3ml 1/4管標(biāo)準(zhǔn)品溶液到1/8管中，充分混合，依此類推。注意Blank EP管中僅有樣品稀釋液。此時(shí)，這7個(gè)EP管中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為150pg/ml，75pg/ml，37.5pg/ml，18.75pg/ml，9.375pg/ml，4.688pg/ml，0pg/ml 。
①計(jì)算所需工作液的總體積：100ul/孔×孔數(shù)。(準(zhǔn)備比總體積多100ul-200ul的量)
②1000×g低速離心1分鐘，將濃縮生物素-抗體收集至管底。
③用抗體稀釋液按1:99的比例稀釋濃縮生物素-抗體，充分混勻。(如將10ul濃縮生物素-抗體加入990ul抗體稀釋液中)
4.HRP-鏈霉親和素(SABC)工作液：
實(shí)驗(yàn)20分鐘內(nèi)準(zhǔn)備好，現(xiàn)用現(xiàn)配，不適合長(zhǎng)時(shí)間存放。
①計(jì)算所需工作液的總體積：100ul/孔×孔數(shù)。(準(zhǔn)備比總體積多100ul-200ul的量。)
②1000×g低速離心1分鐘，將濃縮SABC收集至管底。
③用SABC稀釋液按1:99的比例稀釋濃縮SABC，充分混勻。(如將10ul的濃縮SABC加入990ul SABC稀釋液中)
2.加樣：向標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入100ul各梯度標(biāo)準(zhǔn)品，向樣品孔中加入100ul待測(cè)樣品，向空白孔中加入100ul 樣品稀釋液。貼上覆膜，并在37°C下孵育90分鐘。(將溶液添加到微孔板的底部，輕輕晃 動(dòng)混勻，并盡可能避免接觸管壁和起泡。)
3.洗板2次：取下覆膜，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在潔凈的吸水紙上拍2-3次。每孔加入洗滌緩沖液350ul，不浸泡，棄掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍2-3次。重復(fù)此洗板步驟 2 次。
4.加生物素-抗體工作液：向每孔加入100ul生物素-抗體工作液。貼上覆膜，37°C孵育60分鐘。
5.洗板3次：取下覆膜，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在潔凈的吸水紙上拍2-3次。每孔加入洗滌緩沖液350ul，浸泡1分鐘，棄掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍2-3次。重復(fù)洗板步驟 3 次。
6.加HRP-鏈霉親和素(SABC)：向每孔加入100ul SABC工作液。貼上覆膜，37°C孵育30分鐘。(同時(shí)將整瓶TMB放入37°C溫箱中平衡30min)
7.洗板5次：取下覆膜，用洗滌緩沖液洗板5次，方法參考步驟 5。
8.加TMB顯色底物：向每孔加入90ul TMB顯色底物，貼上覆膜，在37°C避光孵育10-20分鐘。打開酶標(biāo)儀預(yù)熱15min。(注意：根據(jù)顏色的實(shí)際變化，反應(yīng)時(shí)間可以縮短或延長(zhǎng)，但不能超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔中出現(xiàn)較好的藍(lán)色梯度時(shí)，可以終止反應(yīng)。顯色強(qiáng)度不易太弱或過強(qiáng)，控制顯色方法請(qǐng)查閱說明書第二頁相關(guān)文件及二維碼)
9.加反應(yīng)終止液：顯色后，孔內(nèi)液體不可棄掉，向每孔加入50ul反應(yīng)終止液。顏色將由藍(lán)色立即變?yōu)辄S色。添加終止液的順序與添加TMB底物的順序相同。
10.OD值的測(cè)量：立即用酶標(biāo)儀在450nm處讀取OD450數(shù)值并計(jì)算。
五、試劑盒使用時(shí)的注意事項(xiàng)
2.試劑盒開啟后，酶標(biāo)板和標(biāo)準(zhǔn)品的保存條件請(qǐng)參考組件保存條件表格(受潮后活性會(huì)下降)。如發(fā)生使用或保存不當(dāng)導(dǎo)致組件缺損，可申請(qǐng)購買配套組件(如E002凍干標(biāo)準(zhǔn)品)。其它試劑按組件表格所示2-8°C存放即可。
3.提供的試劑體積比標(biāo)簽標(biāo)明的稍多。使用時(shí)請(qǐng)使用無菌一次性吸頭，使用后，須旋緊試劑瓶蓋，以防止微生物污染和蒸發(fā)。
4.手工洗板時(shí)，加洗液的吸頭或滴管，切勿接觸酶標(biāo)板孔。不充分的洗滌或污染容易造成假陽性和高背景。
5.檢測(cè)過程中，請(qǐng)?zhí)釡?zhǔn)備好下一步實(shí)驗(yàn)所需試劑，洗板后及時(shí)將試劑加入板孔，防止板孔干燥，導(dǎo)致檢測(cè)失效。
6.在未經(jīng)確認(rèn)的情況下，請(qǐng)勿將其他批次試劑盒的試劑或其他來源的試劑用于本試劑盒。
7.請(qǐng)勿重復(fù)使用一次性吸頭，以免造成交叉污染。
8.加樣完成，貼覆膜以防孵育過程樣品的蒸發(fā)，在推薦溫度下完成孵育過程。
9.試驗(yàn)中請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服、戴口罩、手套等，做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液樣品時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條例執(zhí)行。
不同的試劑盒實(shí)驗(yàn)操作步驟存在差異，耗時(shí)也有長(zhǎng)有短。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，注意仔細(xì)閱讀說明書以及合理時(shí)間安排。再進(jìn)行數(shù)據(jù)分析就完成啦！
原創(chuàng)作者：武漢菲恩生物科技有限公司
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