細胞凋亡，也被稱為程序性細胞死亡，是一種有序的、由基因控制的細胞死亡方式。它是生物體正常發(fā)育和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關鍵機制。

細胞凋亡過程常伴隨明顯的形態(tài)學變化，比如在凋亡早期，細胞膜上磷脂酰絲氨酸（PS）的外翻。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，它對于磷脂酰絲氨酸（PS）有強的結合力。在細胞凋亡早期，原本只分布在正常細胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側的磷脂酰絲氨酸（PS）會翻向外側，暴露在細胞外環(huán)境中。此時，用標記了熒光素（如FITC）的Annexin V作為熒光探針，可以特異地與外翻的PS結合，從而標記出凋亡早期的細胞。PI（Propidium iodide）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期或者壞死細胞的細胞膜，與細胞核結合呈現(xiàn)紅色。

將Annexin V-FITC與PI聯(lián)合使用，可以實現(xiàn)凋亡早期、凋亡晚期或者壞死細胞的區(qū)分。在流式細胞儀或熒光顯微鏡下觀察，早期凋亡細胞由于細胞膜完整，PI無法進入，僅顯示Annexin V-FITC的綠色熒光；而凋亡晚期或者壞死細胞由于細胞膜通透性增加，PI可以進入并與細胞核結合，同時Annexin V-FITC也能結合外翻的PS，因此這些細胞會同時顯示綠色和紅色熒光。

了解完Annexin V細胞凋亡實驗原理后，下面我們一起看一下具體的實驗流程。

1.獲得好的實驗結果，需要做好實驗的準備工作，先得設置好實驗方案，具體如下（按照Annexin V-FITC/PI試劑盒用流式細胞儀器檢測為例）

2.消化貼壁細胞
對于貼壁細胞，先用適量胰酶(不含EDTA)消化細胞，而懸浮細胞可省去此操作。
需要注意以下幾點：
1）由于EDTA是Ca2+螯合劑，EDTA會絡合Ca2+，從而影響Annexin V與PS的結合，若使用含EDTA的胰酶有可能會造成假陰性，所以建議用不含EDTA的胰酶消化貼壁細胞。
如需使用含EDTA的胰酶消化細胞，有必要在染色之用PBS或結合緩沖液洗滌細胞多次以去除EDTA，從而避免螯合Annexin V所必需的Ca2+。
2）消化細胞的時間不能太久，處理細胞時要輕柔，若過度消化或機械損傷細胞都會導致細胞膜受損，從而造成假陽性。
3）培養(yǎng)基中也存在已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，因此也收集下來進行檢測。
4）檢測細胞密度為80%-90%即可，細胞過密會導致細胞出現(xiàn)大量凋亡，增加了凋亡細胞的比例。

3.重懸細胞
無論是懸浮細胞還是貼壁細胞(消化后)進行細胞重懸，輕柔吹打洗滌，并離收集細胞，制備細胞懸液，進行計數(shù)。

4.取細胞懸液(細胞總數(shù)為1-5×10 ?cells)加入熒光標記的Annexin V和碘化丙啶 (PI)輕輕混勻，室溫避光孵育15min。

5.染色孵育后，立即進行流式細胞儀檢測或熒光顯微鏡檢測。流式細胞儀檢測時，以Annexin V-FITC為例，可使用FITC通道(通常是FL1)檢測Annexin V-FITC。PE通道(通常是FL2)檢測PI。用流式軟件進行分析，以FITC為橫坐標，PI為縱坐標，繪制雙色散點圖。

流式結果圖：

凋亡實驗中主要分析細胞凋亡早期，流式凋亡結果圖各個象限結果代表如下：
左上象限(Annexin V-/PI+)：左上象限為裸核細胞；Annexin V-/PI+象限中細胞數(shù)越多，實驗結果可信度就越低，因盡量控制本象限細胞比例。
左下象限(Annexin V-/PI-)：左下象限為正常的活細胞；
右上象限(Annexin V+/PI+)：右上象限為晚期凋亡細胞或壞死細胞，細胞膜損傷的細胞DNA可被PI著染產(chǎn)生紅色熒光；
右下象限(Annexin V+/PI-)：右下象限為早期凋亡細胞，在細胞凋亡的早期PI無法著染，不會產(chǎn)生紅色熒光信號。

原創(chuàng)作者：武漢菲恩生物科技有限公司