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多聚酶二抗在 IHC 實(shí)驗(yàn)中能顯著提高顯色信號(hào)

點(diǎn)擊次數(shù)：2895 發(fā)布時(shí)間：2022/2/23 10:19:13

多聚酶二抗介紹

過氧化物酶標(biāo)記的抗體方法于 1968 年推出，是大多數(shù)臨床和研究中石蠟包埋組織抗體的實(shí)踐應(yīng)用（Nakane,1968）。然而常規(guī)的二抗-HRP 結(jié)合物每個(gè) IgG 分子上結(jié)合 3 個(gè) HRP 分子。這種結(jié)合物的分子量能滿足常規(guī)的 WB 和 Elisa 實(shí)驗(yàn)要求，但在檢測(cè)目標(biāo)蛋白分子量含量很低時(shí)，如果不通過額外的步驟來放大信號(hào)，會(huì)降低檢測(cè)靶標(biāo)所需的靈敏度。IHC 實(shí)驗(yàn)時(shí)尤為明顯。

在過去的幾十年中，IHC 實(shí)驗(yàn)用試劑和實(shí)驗(yàn)方案上的改進(jìn)增加了這套檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度�；诿�-抗-酶免疫復(fù)合物技術(shù)（PAP 和 APA-AP）（Sternberger et al., 1970）和標(biāo)準(zhǔn)的抗生物素蛋白 / 鏈霉抗生物素蛋白-生物素-復(fù)合物技術(shù)（ABC 或 SABC）以及標(biāo)記的鏈霉素-生物素（LSAB）技術(shù)，再通過多聚酶結(jié)合，這種新方法使檢測(cè)抗原的能力比之提高好幾倍。

然而 PAP 和 APA-AP 方法會(huì)形成巨大的骨架結(jié)構(gòu)導(dǎo)致檢測(cè)物質(zhì)體積過大而容易發(fā)生遮蔽和位阻現(xiàn)象（如細(xì)胞核抗原的檢測(cè)），使其難以進(jìn)入到組織樣品內(nèi)部而導(dǎo)致靈敏度降低（for review see: Shi et al., 1999 ａnd citations therein）。

人體內(nèi)很多組織分布有生物素（維生素 H），它可以和 ABC/SABC 結(jié)合產(chǎn)生非特異性染色。同時(shí)為了減少實(shí)驗(yàn)步驟，加強(qiáng)信號(hào)，需要一種容易滲透到組織內(nèi)部，降低非特異反應(yīng)，并能提高信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)系統(tǒng)來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的方法。

FineTest^®IHC Kits 采用了一種新的多聚酶二抗系統(tǒng)（包括 poly-HRP 羊抗兔 IgG 和 poly-HRP 羊抗小鼠 IgG）。更多的酶可以通過鏈接臂結(jié)構(gòu)鏈接到單分子的抗體上，形成合適的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，從而在免疫組化實(shí)驗(yàn)中提高信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。

各檢測(cè)系統(tǒng)的差異：

Amplification system	Size	Components	The experimental steps	Signal
PAP,APA-AP	Very large＞5000kd	Anti-HRP-IgG HRP HRP-IgG	1.primary antibody 2.PAP or APA-AP	Medium
ABC(SABC)	Large＞2000kd	Avidin(Streptavidin) Biotin-HRP	1.primary antibody 2.biotin-secondary antibody 3.ABC(SABC)	Strong
Poly-HRP-IgG	Medium:700～1200kd	HRP(multiple)-IgG (secondary antibody)	1.primary antibody 2.secondary antibody	Very strong
HRP-IgG(normal)	Small:200～282kd	HRP(1 - 3)-IgG (secondary antibody)	1.primary antibody 2.secondary antibody	Weak or

顯色對(duì)比試驗(yàn)


abcam(ab209101) 多聚酶二抗，DAB 顯色 1 分鐘	FineTest^®多聚酶二抗，DAB 顯色 1 分鐘

市面常見的商品化產(chǎn)品，SABC 顯色 1 分鐘	FineTest^® 多聚酶二抗，DAB 顯色 1 分鐘

原理示意圖：

IHC 測(cè)試結(jié)果
分別進(jìn)行了高濃度和低濃度的目標(biāo)抗原 IHC 實(shí)驗(yàn)。其中一抗，多聚酶二抗和 DAB 試劑盒均來自FineTest^®。
較高濃度的目標(biāo)抗原：

Antibodies	Dilution	Location	Cat. No.
Histone H3.3^(A)	1:150	Nucleus	FNab03888
PCNA^(B)	1:200	Nucleus	FNab06216
a-Tubulin^(C)	1:300	Cylasm, Cytoskeleton	FNab00333
GAPDH^(D)	1:500	Cylasm, Nucleus	FNab03342
Lamin A/C^(E)	1:400	Nucleus	FNab04681
VDAC1^(F)	1:400	Cell membrane, tochondrion	FNab09826
β-actin(monoclonal)^(G)	1:250	Cylasm, Cytoskeleton	FNab00873

較低濃度的目標(biāo)抗原：

Antibodies	Dilution	Location	Cat. No.
TRX- 1^(H)	1:300	Cylasm, Nucleus	FNab09033
PXMP2^(I)	1:150	Peroxisome membrane	FNab06965
TTK^(J)	1:200	Cytoskeleton	FNab09094
MEK3^(K)	1:300	Cylasm, Nucleus	FNab05114
MAP3K3^(L)	1:300	Cylasm	FNab09830
HDAC5^(M)	1:250	Cylasm, Nucleus	FNab03802
P2RX7^(N)	1:250	Cell membrane	FNab06071

人體腎臟組織^（A,D,F,N)，人體肝癌組織^（B,E），人體乳腺癌組織^（C,J,K）, 人體結(jié)腸癌組織^（H,I,L,M)和大鼠心臟組織^（G）。多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgG 和 Poly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:100 稀釋。DAB 染色 10 分鐘，細(xì)胞核用蘇木-精復(fù)染。

陰性對(duì)照試驗(yàn)

人體心臟組織^（1），人體結(jié)腸癌組織^（2），大鼠肝臟組織^（3），人體乳腺癌組織^（4）。一抗為陰性血清，多聚酶二抗 Poly-HRP Goat anti rabbit IgG 和 Poly-HRP Goat anti mouse IgG 按照 1:50 稀釋。DAB 染色 10 分鐘，細(xì)胞核用蘇木-精復(fù)染。

總結(jié)
使用多聚酶二抗做 IHC 實(shí)驗(yàn)，獲得了明顯放大的信號(hào)，未出現(xiàn)非特異性結(jié)合，并且大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。