做過免疫組化的人都知道，實(shí)驗(yàn)看似容易，但真想把結(jié)果做漂亮，還是需要花上很長一段時(shí)間去積累和摸索經(jīng)驗(yàn)。很多人剛開始啥也不懂，一味按照網(wǎng)上操作流程來做，但做的結(jié)果往往并不是十分理想，終結(jié)果未能達(dá)到預(yù)期的效果。現(xiàn)在就來給大家分享下免疫組化實(shí)驗(yàn)中會(huì)會(huì)遇到的問題以及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)。
一、石蠟切片和冰凍切片的區(qū)別是什么？
1.冰凍切片常用于手術(shù)中的快速病理診斷，優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會(huì)使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。
2.石蠟切片廣泛應(yīng)用于常規(guī)制片，優(yōu)點(diǎn)是可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫保存。缺點(diǎn)是步驟繁多，需要抗原修復(fù)。
3.抗體應(yīng)用中能做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，因?yàn)槭炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會(huì)破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是能做石蠟切片的，可同時(shí)做冰凍切片。
二、如何才能充分脫蠟？
1.蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會(huì)引起染色不均勻、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色必須脫蠟，目用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；
2.脫蠟的時(shí)間要靈活調(diào)整。如果在夏天，室溫較高，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5 min 就已足夠。如果在冬天，室溫較低，則脫蠟時(shí)間需要延長，10-20 min 或更長。
3.當(dāng)天切的切片，烤 2 小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色，還必須對切片進(jìn)行加溫 10-20 min，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果會(huì)更好。原則上是要干凈、脫去切片上的蠟。
三、在什么情況下使用 Triton-X100？
1.Triton X-100 是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)(10 μm 以上厚切片) 和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用 Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。
2.其作用原理：Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。
3.Triton X-100 既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。
四、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？
1.一般 3% 過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以避光 10 min；而 0.3% 過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般 10-30 min。
2.用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS 好，能更好保護(hù)抗原和固定組織，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片。
3.現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后 4ºC 避光保存。
五、抗原修復(fù)的條件怎么選擇？
1.抗原修復(fù)是針對石蠟包埋的切片的必要步驟，大多數(shù)甲醛固定的組織在開始染色都要先修復(fù)抗原，這是由于在固定過程中產(chǎn)生了亞甲基橋使蛋白之間交聯(lián)屏蔽了抗原位點(diǎn)。
2.常用的兩種方法為熱修復(fù)法（HIER）和酶解法。推薦兩種常用的熱修復(fù)緩沖液：pH 6.0，10mM檸檬酸鹽緩沖液和pH 9.0，0.5mM Tris-EDTA緩沖液。具體使用哪種緩沖液可以參考您的抗體說明書，通常來講，EDTA緩沖液適合多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液則適用于其他多數(shù)抗體。
3.微波加熱修復(fù)為實(shí)驗(yàn)室常用修復(fù)方法。
六、封閉血清的選擇原則是什么？
1.切片上有一些空余的地方可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性，必須要進(jìn)行封閉后才能進(jìn)行一抗孵育。
2.封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動(dòng)物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會(huì)造成背景。
3.也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。
七、抗體孵育條件的比較？
1.一抗孵育溫度有幾種：4ºC、室溫、37ºC，其中 4ºC 過夜效果較佳；
2.孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37ºC 1-2 h，4ºC 過夜
3.二抗一般室溫或 37ºC 30 min - 1 h
八、DAB 顯色時(shí)間如何把握？
1.DAB 顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗。
2.DAB 顯色時(shí)間很短（如幾或幾十）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時(shí)間。
3.若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能是你面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間。
4.DAB 顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（一抗 4ºC 過夜）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。
九、蘇木素復(fù)染時(shí)間如何把握？
1.蘇木素復(fù)染時(shí)間要根據(jù)溫度，試劑新舊和目標(biāo)物的定位變動(dòng)，一般數(shù)-數(shù)分鐘。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。對于細(xì)胞核定位的指標(biāo)，減少蘇木素染色時(shí)間。
2.鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)（動(dòng)作一定要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。
3.如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。
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