隨著流式細(xì)胞術(shù)應(yīng)用域的不斷擴(kuò)展，流式抗體和熒光標(biāo)記產(chǎn)品的種類和數(shù)量也在不斷增加。多色分析實(shí)驗(yàn)的需求不斷上升，導(dǎo)致抗體選擇和熒光標(biāo)記搭配變得愈加復(fù)雜。這些問(wèn)題對(duì)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行構(gòu)成了挑戰(zhàn)。為了確保流式技術(shù)的成功應(yīng)用，選擇合適的流式抗體是關(guān)鍵。科研工作者可以從以下五個(gè)方面來(lái)篩選適合的流式抗體。

1.抗體的基本要求

流式抗體本身也是抗體，所以先要滿足抗體選擇的基本條件：

靶標(biāo)類型：明確靶標(biāo)是胞內(nèi)還是胞外蛋白。胞內(nèi)蛋白需預(yù)處理以使抗體進(jìn)入細(xì)胞，而胞外蛋白則直接標(biāo)記細(xì)胞表面。

樣品來(lái)源匹配：選擇與樣品來(lái)源相匹配的抗體，避免物種間的交叉反應(yīng)，提高實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。

流式細(xì)胞術(shù)用抗體：務(wù)必選擇標(biāo)注為適用于流式細(xì)胞術(shù)的抗體，以確保其在流式細(xì)胞儀中的性能和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2.流式細(xì)胞儀要求

激光配置：確認(rèn)流式細(xì)胞儀上的激光器數(shù)量和波長(zhǎng)。常見(jiàn)的配置包括 488 nm 和 635 nm 激光器，但一些儀器可能僅裝配一個(gè)激光器。因此，即使是相同型號(hào)的設(shè)備，其激光配置也可能不同，這可能影響你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

濾光片數(shù)量：了解儀器配備的濾光片數(shù)量，即檢測(cè)通道的數(shù)量。這決定了你可以同時(shí)檢測(cè)的參數(shù)數(shù)量。例如，如果儀器有多個(gè)濾光片，你可以同時(shí)檢測(cè)更多的熒光標(biāo)記。

儀器型號(hào)：確認(rèn)流式細(xì)胞儀的具體型號(hào)，有助于了解其檢測(cè)通道的配置。不同型號(hào)的儀器可能會(huì)有不同的通道配置，即使是相同的熒光標(biāo)記，其在不同儀器上的檢測(cè)通道設(shè)置也可能有所不同。

3.熒光標(biāo)記的選擇

在選擇流式細(xì)胞術(shù)抗體時(shí)，建議優(yōu)先使用直接標(biāo)記熒光的抗體。相比于間接標(biāo)記的二抗，直接標(biāo)記抗體可以減少實(shí)驗(yàn)步驟，避免多次清洗帶來(lái)的細(xì)胞浪費(fèi)，并提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。熒光的強(qiáng)度也會(huì)影響結(jié)果，根據(jù)抗原表達(dá)的強(qiáng)弱及分群情況選擇適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記。如果抗原表達(dá)較弱或分群不明顯，建議使用強(qiáng)熒光如PE，以增強(qiáng)信號(hào)；而對(duì)于抗原表達(dá)強(qiáng)或分群明顯的情況，可以選擇弱熒光如FITC。常見(jiàn)熒光的強(qiáng)度排序?yàn)椋篜E > APC > PE-Cy5 > PerCP-Cy5.5 > FITC。還可以考慮使用新型熒光如Alexa Fluor和eFluor，這些標(biāo)記物具有更高的亮度、優(yōu)良的激光穩(wěn)定性和對(duì)pH值的不敏感性。例如，盡管Alexa Fluor 488和FITC使用相同的檢測(cè)通道，但Alexa Fluor 488在信號(hào)強(qiáng)度和淬滅時(shí)間上明顯優(yōu)于FITC。

4.多色配色原則

在流式細(xì)胞術(shù)中，設(shè)計(jì)熒光標(biāo)記方案時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

通道選擇：每個(gè)檢測(cè)通道只能使用一種熒光標(biāo)記。各通道之間的熒光標(biāo)記可以自由搭配。例如，如果在FL1通道使用了FITC標(biāo)記的抗體，那么不能在同一實(shí)驗(yàn)中再選擇Alexa Fluor 488標(biāo)記的抗體。不過(guò)，其他通道的抗體可以選擇PE、APC等不同的標(biāo)記物進(jìn)行組合。

熒光重疊：盡量減少熒光素光譜的重疊，以避免補(bǔ)償困難。例如，PE-Cy5與APC的光譜重疊較大，會(huì)導(dǎo)致補(bǔ)償問(wèn)題，建議使用PE-Cy5.5或PerCP-Cy5.5來(lái)避免這種情況。常用的四色熒光組合為：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、APC。

多色分析：在進(jìn)行多色分析時(shí)，特別是五色以上的實(shí)驗(yàn)，可能會(huì)受到熒光標(biāo)記種類的限制。建議參考多家抗體公司的產(chǎn)品，并在需要時(shí)咨詢業(yè)人員，以設(shè)計(jì)合適的實(shí)驗(yàn)方案。

5.同型對(duì)照抗體的選擇

同型對(duì)照（Isotype Control）用于消除抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景染色，是真正的流式陰性對(duì)照。它不僅幫助設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，還省去復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)封閉步驟。

選擇同型對(duì)照時(shí)，應(yīng)使用與一抗相同種屬、亞型、亞鏈及熒光標(biāo)記的免疫球蛋白，并保持劑量一致。熒光一抗的說(shuō)明書(shū)通常會(huì)提供對(duì)應(yīng)同型對(duì)照的貨號(hào)。如果使用純化的一抗加熒光標(biāo)記的二抗，則應(yīng)選擇相應(yīng)的同型對(duì)照抗體，例如，純化CD3+PE標(biāo)記的二抗樣品管應(yīng)使用純化的同型對(duì)照加PE標(biāo)記的二抗作為對(duì)照。對(duì)于細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗原表達(dá)低且類似抗原眾多的情況，同型對(duì)照可能因非特異性結(jié)合而導(dǎo)致較高表達(dá)，此時(shí)推薦使用空白對(duì)照等其他陰性對(duì)照。不熟悉流式操作或檢測(cè)胞內(nèi)因子時(shí)，建議使用同型對(duì)照；而熟悉操作且了解抗體表達(dá)的用戶可以考慮省略同型對(duì)照。

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