親愛的科研小伙伴們，你是否曾在流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)中，為如何找到合適的抗體用量和抗體濃度而苦惱？現(xiàn)在，就讓我們一起揭開抗體滴定的神秘面紗，讓你的流式分析更加準(zhǔn)確！

1.什么是抗體滴定？

抗體滴定，是流式細(xì)胞術(shù)中的一項(xiàng)關(guān)鍵步驟。它通過(guò)逐步稀釋抗體，找到既能有效結(jié)合目標(biāo)抗原，又能避免非特異性染色的適宜濃度。

一般抗體供應(yīng)商都會(huì)推薦抗體使用量， 如菲恩生物包裝抗體。但為了達(dá)到良好的實(shí)驗(yàn)效果及節(jié)省抗體，我們則需要自己做滴定，尤其在多指標(biāo)流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，抗體滴定就更加重要了。

2.為什么需要抗體滴定？

提升信噪比：合適抗體濃度能提升信號(hào)與噪聲的比例，讓你的數(shù)據(jù)更加清晰可靠。

節(jié)約成本：避免使用過(guò)量抗體，減少實(shí)驗(yàn)成本，同時(shí)降低樣本自發(fā)熒光。

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)效果：不同實(shí)驗(yàn)條件（如細(xì)胞類型、實(shí)驗(yàn)方案、溫度等）下，合適的抗體濃度可能不同，滴定確保每次實(shí)驗(yàn)都能達(dá)到良好狀態(tài)。

3.抗體滴定的步驟

準(zhǔn)備抗體稀釋液：根據(jù)廠家推薦的起始濃度，進(jìn)行倍比稀釋，通常設(shè)置多個(gè)濃度梯度。

細(xì)胞處理：將待測(cè)細(xì)胞與稀釋后的抗體孵育，確�？贵w充分結(jié)合到細(xì)胞表面。

洗滌與重懸：去除未結(jié)合的抗體，減少背景干擾。

流式檢測(cè)：使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各濃度下的熒光信號(hào)，記錄數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)分析：計(jì)算染色指數(shù)（SI），選擇合適的抗體濃度。

4.數(shù)據(jù)分析

染色指數(shù)（SI）：衡量陽(yáng)性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群分離程度的指標(biāo)，SI越大，分離效果越佳。

染色指數(shù)（SI）計(jì)算公式

選擇SI越大時(shí)，對(duì)應(yīng)的染色濃度作為合適的抗體濃度。

5.注意細(xì)節(jié)

1）關(guān)于全陽(yáng)的細(xì)胞的滴定，可以在樣本染色后加入未染色的細(xì)胞；

2）對(duì)于CD3、CD4、CD8這類分群明顯且間隔非常開的指標(biāo)，只做細(xì)胞性質(zhì)確定設(shè)門用的時(shí)候，可不進(jìn)行滴定，只滴定那些需要分析比例或MFI的指標(biāo)；

3）對(duì)于表達(dá)量比較少的稀有細(xì)胞群體，在染色時(shí)，可加入該群細(xì)胞的父細(xì)胞群的抗體；

4）如果樣本中有大量的死細(xì)胞，在滴定過(guò)程中，要先加入死活染料區(qū)分死活，細(xì)胞表達(dá)Fc受體時(shí)，需要加Fc受體阻斷劑。

5） 在一定的細(xì)胞密度范圍內(nèi)，抗體的染色指數(shù)只與抗體的濃度有關(guān)，與細(xì)胞密度無(wú)關(guān)。比如染色體系不變，細(xì)胞增加10倍，可以不用增加抗體濃度。

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